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PCR實驗室被污染處理探究
點擊次數(shù):344 更新時間:2025-04-08

    有實驗室的地方,就不可避免的會出現(xiàn)實驗室污染。實驗室的污染,不僅會影響實驗與科研的質量和效果,還對實驗室工作人員的身體健康有損害,現(xiàn)在來一起了解下PCR實驗室的污染原因及解決方法。             

PCR實驗室污染分類:

標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染,或標本放置時,由于密封不嚴溢于容器外,或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導致彼此間的污染。

PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

PCR擴增產物污染:這是PCR反應中主要-常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大,遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限,所以極微量的PCR產物污染,就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視,可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地搖動反應管,開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。

實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室,這個問題也比較常見,因為克隆質粒在單位容積內含量相當高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細胞內的質粒,由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力,其污染可能性也很大。

、 污染監(jiān)測

一個好的實驗室,要時刻注意污染的監(jiān)測,考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。

對照試驗:

1、陽性對照:在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照,它是PCR 反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。

2、陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNARNA,進行PCR擴增,以監(jiān)測試劑是否污染。

3、重復性試驗。

4、選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增。

 

、防止污染的方法

進行PCR操作時,操作人員應該嚴格遵守一些操作規(guī)程,-大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。

劃分操作區(qū):目前,普通PCR尚不能做到單人單管,實現(xiàn)全閉管操作,但無論是否能夠達到單人單管,均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內進行,PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內進行:

試劑準備區(qū)。

標本制備區(qū)。

PCR擴增區(qū)及分析區(qū)。

切記:任何一間的產物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

分裝試劑:PCR擴增所需要的試劑均應在生物安全柜、裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中,不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA

PCR用水應為高壓的雙蒸水;

引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區(qū)配制;

引物和dNTP應分裝儲存,分裝時應標明時間,以備發(fā)生污染時查找原因。

、PCR實驗操作注意事項:

盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一。因此,不僅要在進行擴增反應是謹慎認真,在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應該注意:

1. 戴一次性手套,若不小心濺上反應液,立即更換手套;

2. 使用一次性吸頭,嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染;

3. 避免反應液飛濺,打開反應管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;

4. 操作多份樣品時,制備反應混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應的精-確度;

5. 后加入反應模板,加入后蓋緊反應管;

6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照,即可驗證PCR反應的可靠性,又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性;

7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由于加樣器容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染,-好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應該,不能交叉使用,尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū);

8. 重復實驗,驗證結果,慎下結論。


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